INTRODUCCION

La unión del antígeno con el TCR no es suficiente para dar lugar a una respuesta eficaz. Para que esta respuesta se lleve a cabo se requiere la participación de una serie de moléculas conocidas globalmente como accesorias, y cuya función es la de contribuir al desarrollo de una respuesta inmune efectiva facilitando la interacción entre las distintas células. Se forma así lo que se denomina sinapsis entre linfocitos T y célula presentadora de antígeno.

Las principales moléculas que están implicadas en este fenómeno de reconocimiento son el CD4, CD8, CD2, CD45 y CD28 y sus ligandos respectivos. Todas estas moléculas de adhesión también juegan un importante papel en la transducción de señales y activación de la célula T. En la figura se recoge un esquema de las distintas posibilidades de activación de los linfocitos T según las moléculas que intervienen en los procesos de reconocimiento y adhesión intercelular.

Las moléculas CD4 y CD8 son glicoproteínas cuyos ligandos naturales son las moléculas del MHC de clase II y de clase I respectivamente. Estructuralmente ambas moléculas pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas, pero mientras la CD4 está formada por una sola cadena, el CD8 lo está por dos cadenas, alfa y beta. Mientras el CD4 se expresa en la mayoría de los linfocitos T cooperadores, mientras que el CD8 se presenta, principalmente, en aquellos linfocitos T con función citotóxica.

La molécula CD28 es de especial importancia incrementando la estabilidad de la interacción celular. El CD28 se expresa en todos los linfocitos CD4 y aproximadamente en el 50% de los linfocitos CD8, sus ligandos naturales pertenecen a la familia B7 (B7‐1, CD80; B7‐2, CD86). El CD28, además de su papel en el proceso de adhesión, también participa en el mecanismo de transducción de señal y activación de la célula T. Una variante de esta molécula es el CTL‐4 que, a diferencia del CD28, se expresa sólo de modo transitorio después de la activación de las células Т у confiere una señal inhibidora al linfocito a diferencia del CD28 que como hemos dicho confieren señales de activación. Esta posibilidad de la presencia de CD28 o CTL‐4 define que el linfocito se active o se inhiba, lo que tiene gran trascendencia en el proceso regular de la activación de los linfocitos T.

La molécula CD2 es una glicoproteína de adhesión que contribuye a la unión del linfocito T a la célula presentadora. Su ligando natural es el CD58 ( LFA‐3) y se expresan en la superficie de todas las células con función de APC.


OBJETIVOS
a. Aislar linfocitos humanos de sangre periférica.
b. Detección de CD2 por la formación de rosetas con GRC.

MATERIALES Y METODOS
MATERIALES
- Solución de ficoll
- Solución de hanks
- GRC frescos al 0,5% en hanks
- Albúmina bovina al 12%
- Heparina
- Tubos d ensayo
- Láminas
- Microscopio
- Refrigeradora

PROCEDIMIENTO

1. Tomar 1 ml de sangre desfibrinada y colocarlo en un tubo.
2. Agregar 4 ml de PBS para diluir la sangre 1:5.
3. Mezclar bien y depositar en zona 3 ml de sangre en un tubo que contenga 1,5 ml de Ficoll-Hypaque.
4. Centrifugar a 4000 rpm por 15minutos
5. Separar suavemente el anillo de linfocitos, con la pipeta de pasteur y transferirlos a un tubo pequeño. Agregar 4,5 ml de PBS
6. Centrifugar a 800 rpm durante 3 minutos. Descartar el sobrenadante y agregar 2ml de PBS. Resuspender las células, agitando suavemente. Esto se hace para lavar los linfocitos y retirar restos de Ficoll-Hypaqué
7. Centrifugar nuevamente a 800 rpm por 3 minutos y descartar el sobrenadante resuspender las células en aproximadamente 0,5 ml de PBS agregando una gota de suero de ternera fetal

FORMACIÓN DE ROSETAS T
1. La suspensión de células debe tener 1 a 10 x 10⁶ células/mL, y debe contener 90-90% de células vivas. Las rosetas T sólo se forman alrededor de las células vivas. Para lo cual se depositan en un tubo de prueba:
- 0,1 ml de los linfocitos en suspensión
- 0,1 ml de GRC
- 0,14 ml de hanks
- 0,12 mls de albúmina bovina al 12%

2. Incubar a 37°C por 30 minutos.
3. Centrifugar a 1000 rpm por 5 minutos
4. Colocar el tubo sin resuspender a 4°C de 18-24 horas
5. Decantar y agregar al sedimento 3 gotas de azul de toluidina , mezclar suavemente y reposar por 30 minutos
6. Efectuar la lectura.

Valores normales : 69 a 85%

RESULTADOS

Evidenciar la formación de rosetas T